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BiozellenFF 人多能干細胞培養基
產品概述：
BiozellenCM? 人多能干細胞培養基
（BiozellenCM? Human Pluripotent Stem Cell Medium）
Catalog No B-SM-00002-500
Specification 500ml
Storage 2-8℃ ， 12個月
一、產品介紹
BiozellenCM? 人多能干細胞培養基是一款配方優化、化學成分明確、專用于無飼養層培養體系下的人類誘導多能干細胞 (Induced pluripotent stem cells, iPSCs) 或人類胚胎干細胞 (Human embryonic stem cell) 的無血清培養液。本產品有助于干細胞克隆的快速形成和擴展(Colony formation and expansion)，并且連續傳代 50 次后其自我更新能力和未分化狀態無改變。
二、產品信息
名稱 | 貨 號 | 規 格 | 儲存溫度&質保期 |
BiozellenCM? 人多能干細胞基礎培養基 | B-SM-00002-500 | 500 mL | 2-8℃，避光保存12 個月 |
BiozellenCM? 人多能干細胞培養基添加劑（50×） | B-SM-00002-A | 10 mL | -20℃，避光保存12 個月 |
三、用前須知
1. 初次使用時，37℃水浴解凍人多能干細胞培養基添加劑（B-SM-00002-A），解凍后的各組分試劑或一次性配置并使用，或分裝于-20℃凍存（不超過12個月）；
2. 人多能干細胞培養基配置：按照2% 的比例，將解凍后的人多能干細胞培養基添加劑（B-SM-00002-A）添加至人多能干細胞基礎培養基中，混勻后置于 2-8 ℃避光保存，建議 1個月內使用。如規定時間內不能用盡，建議分裝于-20℃凍存（不超過12個月）。
四、iPSC 培養方法步驟
1、基質膠分裝與孔板包被
（1）. 應分裝和冷凍保存 BiozellenGel 干細胞基質膠（B-P-00011-10），分裝后的小包裝可在-20°C 下最多儲存24 個月。
（2）. 提前一天將分裝的基質膠至于4°C冰箱中解凍。解凍后的基質膠凝膠始終置于冰上，并使用預先冷卻的培養基和移液器，以避免產品凝膠化。
（3）. 用預冷的DMEM/F12 基礎培養基稀釋基質膠（稀釋比例為1:50），以 1mL/孔加入預冷的 6 孔板中，輕輕搖動板子以確保混合液均勻地覆蓋在板上。
（4）. 將 6 孔板轉移到37°C的培養箱中至少孵育1h。 在培養板可供使用之前，請勿移除包被液。如不立即使用，可將包被孔板密封，放置于2-8 ℃最多儲存7 天。
（5）.使用前吸棄包被液。如已將培養板在 2 - 8℃下儲存，則在移除包被液之前，將培養板在培養箱 (37℃) 下放置 30 min。
2、iPSC 細胞復蘇
（1） 將 iPSC凍存管放在 37 °C 的水浴中快速融化細胞，并在水浴時不停搖晃冷凍管，以確保快速解凍。
（2） 開蓋前用 75％乙醇或等效消毒劑對冷凍管進行消毒。
（3） 用無菌移液管將冷凍保護劑 / 細胞混合物轉移到15 mL離心管中。再吸6 mL 預溫的人多能干細胞培養基，并輕柔混勻。
（4） 將細胞以300 x g 離心 3 min，小心吸棄上清液。
（5）用含有Y27632的培養基（終濃度10μM）輕輕重懸 iPSC，然后將其轉移到鋪好的 6 孔板中。輕輕搖動板子以均勻分布細胞；
（6） 將 6 孔板放回 37°C 的培養箱中培養；
（7）. 每天更換培養基(不含Y27632)。在解凍后大約 5 - 7 天內檢查可進行傳代的未分化集落（有密集的中心）。
3、iPSC細胞傳代
當細胞集落變得較大、中心變得密集和明亮（對比其邊緣）而相鄰的集落開始融合時，這時可進行傳代。根據接種的細胞團的大小和密度，傳代周期為 5 天左右。如果太早對集落進行傳代或傳代太過頻繁，則細胞可能吸附不好、產量將會減少且細胞可能分化。如果太晚對集落進行傳代，培養物將開始顯示分化跡象（特點是細胞類型出現不同的形態）。
（1） 將無菌DPBS、溫和型細胞消化液（B-SM-00003-100）和人多能干細胞培養基溫熱至室溫。
（2） 吸棄培養基，小心加入 2 mL DPBS 緩沖液漂洗細胞，稍晃勻后即吸棄漂洗液。
（3） 向每孔加入1 mL 溫和型細胞消化液。將板在 37°C 下孵育 3-5 min。
（4） 當顯微鏡下觀察大部分細胞變圓、脫落時，小心加入 5 mL DMEM/F-12或人多能干細胞培養基終止。
（5） 使用移液槍小心吹打吹打孔底細胞，并將細胞懸液吸取至15 mL離心管中，300 x g 離心 3 min，小心吸棄上清液。
（6） 根據傳代比例，吸取適量的含有10 μM Y27632的人多能干細胞培養基重懸細胞，并接種至新的包被孔板中。
備注：一般傳代周期為 5 天左右，傳代比例為 1：3-1：6。如果集落過于密集或過于稀疏，則下一次傳代時相應地調整傳代比例。
（7） 每天更換培養基(不含Y27632)。
4、iPSC細胞凍存
（1） 準備無菌細胞凍存管、程序性凍存盒；DPBS、溫和型細胞消化液（B-SM-00003-100）、無血清細胞凍存液和人多能干細胞培養基提前溫熱至室溫。
（2） 為提高凍存活率，建議對處于對數生長期（匯合度70-80％）的人多能干細胞培養基進行凍存操作。
（3） 取出細胞培養孔板，吸棄培養基后加入 DPBS 漂洗細胞一次。
（4） 向每孔加入1 mL 溫和型細胞消化液。 將板在 37°C 下孵育 3-5 min。
（5） 當顯微鏡下觀察大部分細胞變圓、脫落時，小心加入 5 mL DMEM/F-12或人多能干細胞培養基中和。
（6） 使用移液槍小心吹打吹打孔底細胞，并將細胞懸液吸取至15 mL離心管中，300 x g 離心 3 min，小心吸棄上清液。
（7）. 將細胞重懸于 1mL 含有10 μM Y27632的人多能干細胞培養基中，取10μL細胞懸液計數。
（8） 300 x g 離心 3 min，小心吸棄上清液。根據細胞總數加入適量預冷的無血清細胞凍存液（含10 μM Y27632），重懸后以 1mL分裝至細胞凍存管中。
備注：建議凍存比例為1-2 × 106 /管。
5、 將細胞凍存管放入程序性凍存盒中，并轉移到-80°C的超低溫冰箱中過夜。將細胞再轉移至液氮灌中。
